2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数导学案 【学习目标】
1．解释选择培养基； 2．阐明统计菌落数目、设置对照、土壤取样及稀释的方法； 3．掌握从土壤中分离分解尿素的微生物及进行平板计数的方法。
【自主预习】
一、研究思路 1．筛选菌株 (1)Taq细菌能耐受93℃左右的高温，是美国微生物学家托马斯·布鲁克于 1966 年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。
(2)选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
(3)选择分解尿素细菌的培养基特点：尿素是唯一氮源；按物理性质归类为固体培养基。
2．统计菌落数目 (1)测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。
(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目 ①为了保证结果准确，一般设置多于 3 个平板，选择菌落数在30～300 的平板进行计数，并取平均数。
②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
3．设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用培养该种微生物的无菌培养基作为空白对照。
对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
二、实验设计
关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：
1．土壤取样 土壤微生物中 70%～80%为细菌，主要分布在距地表 3～8_cm 的近中性土壤中。
2．样品的稀释 样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。由于不同微生物在土壤中含量不同，因此分离不同的微生物要选用不同的稀释度范围，以保证获得菌落数在 30～300 之间、适于计数的平板。一般来说，细菌稀释度为 10 4 、10 5 、10 6 倍，放线菌稀释度为 10 3 、10 4 、10 5倍，真菌稀释度为 10 2 、10 3 、10 4 倍。第一次实验时，可将稀释范围放宽些，以保证能从中选择出适于计数的平板。
3．微生物的培养与观察 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在 30～37℃培养 1～2 d，放线菌一般在 25～28℃培养 5～7 d，霉菌一般在 25～28℃的温度下培养 3～4 d。
在菌落计数时，每隔 24 h 统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时
间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。菌落的特征包括形状、大小、隆起程度、颜色等方面。
三、对分离得到的分解尿素细菌的鉴定
在对能分解尿素的细菌进行初步筛选后，还需要借助生物化学的方法对分离的菌种作进一步的鉴定。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，pH 升高。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果 pH 升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
【互动探究】
在选择培养基上生长的微生物是否一定是所需要的微生物？为什么？
【课堂练习】
1. 某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难以降解的有机化合物 A，研究人员用化合物 A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物 A 的细菌(“目的菌”)。实验的主要步骤如下。请分析回答问题：
(1)培养基中加入化合物 A 的目的是筛选______，这种培养基属
于______培养基。
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的______，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是______。
(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物 A 含量______的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量______。
(4)转为固体培养时，常采用______的方法接种，获得单菌落后继续筛选。
(5)若要研究“目的菌”的生长规律，可将单个菌落进行液体培养，采用______的方法进行计数，以时间为横坐标，以______为纵坐标，绘制生长曲线。
(6)实验结束时，使用过的培养基应该进行______处理后，才能倒掉。
答案：(1)“目的菌” 选择 (2)化合物 A 异养需氧型 (3)减少 增加 (4)平板划线 (5)定期取样 “目的菌”数目的对数 (6)灭菌 2. 将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到 M 培养基。
回答下列问题：
(1)M 培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M 培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物
质，营养物质类型除氮源外还有________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________(答出两点即可)。
(3)若在 M 培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 110、140 和 149，取平均值 133； 乙同学涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 27、169 和 176，取平均值 124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________。
答案：(1)细菌 选择 (2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸 (3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 (4)乙同学的结果中，1 个平板的计数结果与另 2 个相差悬殊，结果的重复性差
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