目录
摘要 ............................................................................................................................. Ⅰ Abstract ........................................................................................................................ Ⅱ 1、引言 ......................................................................................................................... 1 1.1 研究的目的与意义 .......................................................................................... 1 1.2 研究的现状 ...................................................................................................... 1 1.2.1 姜辣素具有重要的药理学作用 ............................................................ 1 1.2.2 6-姜酚的研究现状 ................................................................................. 1 1.2.3 PAL 基因功能研究进展 ........................................................................ 1 1.2.4PAL 基因对其他次生代谢物的调控效果研究 ..................................... 1 1.3 要解决的主要问题 ................................................................................... 2 2、材料与方法 ............................................................................................................. 2 2.1 实验材料 .......................................................................................................... 2
2.1.1 实验植物 ................................................................................................. 2
2.1.2 实验所需主要试剂 ................................................................................. 2
2.1.3 实验所需主要仪器 ................................................................................. 2 2.2 方法 .................................................................................................................. 2 2.2.1NaCl 胁迫处理与样品采集 .................................................................... 2 2.2.2 生姜块茎总 RNA 的提取 ...................................................................... 2 2.2.3 合成 cDNA 的第一链 ............................................................................ 3 2.2.4 生姜 PAL 基因在 Nacl 胁迫下的表达分析 ......................................... 3 3、结果与分析 ............................................................................................................. 3 3.1 竹根姜根茎总 RNA 的提取与 cDNA 的合成 .............................................. 3 3.2PAL 基因在不同 NaCl 胁迫下的表达分析 .................................................... 4 4、讨论 ......................................................................................................................... 4 参考文献 ....................................................................................................................... 6 致谢词 ........................................................................................................................... 7
I
姜 生姜 PAL 基因在 NaCl 胁迫下的表达分析
摘要 ：
生姜是可以药食两用的具有极高价值的传统农作物。具有抗呕吐、止咳嗽、止防痴呆、解药毒、驱散寒邪、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血脂、降血糖等作用。研究发现其发挥药理学活性的主要物质是姜辣素，其中 6-姜酚则是其核心成分，常常都是被用来作为评价生姜类药物品质的药用价值指标。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）是在苯丙烷途径中的第一个酶，作用是苯丙烷类代谢中的限速酶。PAL 基因与 6-姜酚的合成密切联系。本研究以重庆本地竹根姜“渝姜 1 号”地下根茎组织为实验材料，在前期已经克隆 PAL 基因的基础上，用不同浓度的 NaCl 溶液对竹根姜进行处理，然后采用 qRT-PCR 技术对其中的 PAL 基因表达量进行检测，再对 NaCl 胁迫下PAL 基因的表达情况进行分析总结。该结果在理论上为研究生姜 PAL 基因的功能奠定基础，在实践中为后期实现人工合成调控 6-姜酚提供依据。
关键词：
生姜；PAL 基因；NaCl 胁迫；表达分析
II Expression analysis of PAL gene in Ginger under NaCl stress
Landscape architecture:Ou Xingyou
Adviser ：Li Zhexin Abstract：Ginger is a traditional crop with high value that can be used as medicine and food. It has effects in resisting emesis, relieving cough, preventing dementia, relieving toxic materials, dispelling pathogenic cold, resisting oxidation, resisting tumor, resisting inflammation, reducing blood lipid, lowering blood sugar, etc. Studies have found that the main substance that exerts pharmacological activity is gingerol, of which 6- gingerol is the core component, which is often used as a medicinal value index to evaluate the quality of ginger drugs. Phenylalanineammonialyase (PAL) is the first enzyme in the phenylpropane pathway and acts as a rate-limiting enzyme in phenylpropane metabolism. PAL gene is closely related to the synthesis of 6- gingerol. In this study, the underground rhizome tissue of Chongqing local bamboo root ginger "Yujiang No.1" was used as experimental material. Based on the PAL gene cloned earlier, bamboo root ginger was treated with different concentrations of NaCl solution, and then the expression of PAL gene was detected by qRT-PCR technology, and then the expression of PAL gene under NaCl stress was analyzed and summarized. The results lay a theoretical foundation for studying the function of ginger PAL gene and provide a basis for the artificial synthesis and regulation of 6- gingerol in later stage in practice.
Keywords:Ginger; PAL gene; NACL stress; expression analysis
第 1 页 共 7 页 1 、引言
1.1 研究的目的与意义 生姜是可以药食两用的具有极高价值的传统农作物，具有抗呕吐、防痴呆、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血脂、降血糖等作用 [1] ，其发挥药理学活性的主要物质是姜辣素，6-姜酚占姜辣素成分的75%以上，常常都是被用来作为评价生姜类药物品质的药用价值指标。
苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）基因催化 L-苯丙氨酸非氧化脱氨生成反式肉桂酸，是苯丙烷代谢途径的限速酶，PAL 基因与 6-姜酚的合成有密切联系。本研究在前期已经克隆 PAL 基因的基础上，以不同浓度 NaCl 处理竹根姜植株，并采集重庆本地竹根姜“渝姜 1 号”地下根茎组织为实验材料，进行生姜 PAL 基因的表达量检测与分析，为后续研究 PAL 基因调控 6-姜酚生物合成的功能奠定基础。
1.2 研究的现状 1.2.16-姜酚的研究现状 生姜之中发挥其药理学活性的物质主要是姜辣素，它是姜酚、姜脑等各种与生姜有关辣味物质的总称。根据近几年来的研究发现，姜辣素具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、防痴呆、抗炎、抗动脉粥样硬化等药理作用 [2] 。其中得姜辣素是药理作用化学结构基础，姜辣素是由多种物质构成的混合物，其中可分为姜酚、姜油酮、姜酮、姜烯酚副等类型，6-姜酚便是姜辣素中含量最高的物质。目前关于 6-姜酚药理学功能的研究较多。周艳芳等人发现 6‐姜酚可能通过抑制 mTOR/P70‐S6K 降低 Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)衰老 [3] 。吕祥威等人发现 6-姜酚可减轻氧化应激减轻心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)，其机制可能是通过抑制氧化应激减轻心肌细胞凋亡 [4] 。查询得知经曾慧兰等人研究发现在诱导白血病细胞株 K562 及 MOLT4 细胞 ROS 水平升高中 6-姜酚起到了重要的作用 ，能够降低细胞 ΔΨm,以线粒体为途径介导白血病细胞凋亡等。但是从分子层面研究生姜 6-姜酚合成与积累的相关研究未见报道。
1.2.2PAL 基因的功能研究进展 PAL（苯丙氨酸解氨酶）是苯丙烷途径的第一个酶，是苯丙烷类代谢的关键酶以及限速酶。目前PAL 基因已从葡萄、芒果、苋菜、黄灯笼、一品红、苹果、鸭梨、菊花、龙眼、山药等多种植物中得到分离纯化 [5-15] 。PAL 基因在不同植物中以基因家族的形式存在，其中的拟南芥中有 4 个 PAL 基因家族成员，青天葵有 3 个，苹果基因组中共 8 个，沙棘 3 个；其中 PAL 基因的活性在不同种植物中是不同的，比如水稻叶中的 PAL 活性远比小麦的高；运用 PCR、RACE 和 TAIL-PCR 技术从大薯地下块茎中克隆到同一个 PAL 基因的 3 个片段，之后再将 3 个片段的 cDNA 序列拼接，之后获得一段大小为 2 376bp 的 PAL 基因，也是一段全长 cDNA 的序列，然后经过一系列的实验，从该实验结果之中，得到了一系列的数据，也说明了 PAL 基因在整体的系统进化上相对保守；经过 RT-PCR 技术分析，表明了 PAL 仅仅在植株的地下块茎中表达，且之中的表达丰富度在收获前就会逐渐降低。根据上述案例说明在同一株农作物植物中，组织部位的不同 PAL 的 活性表达也是不一样的，通常情况瞎，植物组织越嫩的部位 PAL 活性越高。在研究 PAL 对其他次生代谢物的（木质素）的调控效果
第 2 页 共 7 页 [16] ，此实验中选择移栽二年生的慈竹新生嫩枝作为材料，通过喷洒不同浓度的 GA3 溶液，以此来研究此溶液对慈竹木质素和纤维素含量的动态积累以及对 PAL 基因活性起到了怎样的调控作用。此实验结果表明，不同浓度的 GA3 处理对木质素含量动态积累的调控效应以及 PAL 基因活性是不同。分析结果说明，GA3 浓度与慈竹纤维素含量间呈极显著正相关（r=0.9983），木质素含量以及 PAL 活性间呈极显著正相关（r=0.8311）。研究发现黑米在成熟的过程中，种皮内会积聚形成大量的花色苷色素（anthocyanin），从而使其糙米显露出不同的颜色，说明果实在成熟期间花色苷的形成与 PAL基因有联系，表现为提高 PAL 活性,能增进着色程 [17] 。
综上所述，本研究在前期已经克隆 PAL 基因的基础上，以不同浓度 NaCl 处理竹根姜植株，并采集重庆本地竹根姜“渝姜 1 号”地下茎组织为实验材料，进行生姜 PAL 基因的表达量检测于分析，初步鉴定生姜 PAL 基因的功能，以期为进一步研究生姜 PAL 基因功能提供理论基础。
1.3 拟解决的主要问题 PAL 基因是生姜药理成分 6-姜酚生物合成途径上游苯丙酸途径的一个重要调控基因，但是该基因在生姜中的功能尚未被鉴定。本研究对 NaCl 胁迫下 PAL 基因的表达情况进行分析，在理论上为研究生姜 PAL 基因的功能奠定基础，在实践中为后期实现人工合成调控 6-姜酚提供依据。
2 、材料与方法
2.1 实验材料 2.1.1 实验植物 重庆本地竹根姜“渝姜 1 号”地下根茎组织为实验材料，采自重庆市永川区五间镇生姜基地。
2.1.2 实验所需主要试剂 TaqDNA 聚合酶、Smal、RevertAid First strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒（Thermo 公司）、OminiPlant RNA Kit （DNase）全能型植物 RNA 提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）、Gel Extraction Kit（100）琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、pfu 酶、5×In-Fusion HD Enzyme Premix。
2.1.3 实验所需主要仪器 H1850 小型高速离心机（湖南湘仪离心机有限公司）、B-500 超微量分光光度计（上海元析仪器有限公司）、QYC-200 恒温摇床（上海福玛实验设备有限公司）、JY200C 核酸电泳系统（北京君意东方电泳）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）、电热恒温水浴锅、Powerler梯度 PCR 仪（成都立德赛科技有限公司）。
2.2 方法 2.2.1NaCl 胁迫处理与样品采集 竹根姜“渝姜 1 号”催芽一个月后对其进行 NaCl 胁迫处理，采用了 6 种不同浓度 NaCl（0、25、50、75、100、125 g·L -1 ），每两天处理一次，10 天后对地下根茎材料进行采集，采集到的生姜块
第 3 页 共 7 页 茎在液氮中迅速冷冻并置于-80 度冰箱保存备用。
2.2.2 生姜根茎总 RNA 的提取 把根茎材料取出后，在液氮环境中把材料研磨成超细粉末；取适当粉末，放入离心管，加入 1ml的 fruitmate，用力震荡成半浑浊状；在高速离心机中 4℃，12000rpm 离心 5min，此时样品分为上中下三层，将最上层清液 600ul 移到新的离心管中；加入 600ulRNAiso、plus，静置 5min，再在高速离心机中 4℃，12000rpm 离心 5min；把上层清液全部取出放到新的离心管中，再加入与 RNAiso、plus等体积/半体积氮仿（600ul）去 pro，颠倒摇匀，静置 5min，在高速离心机 4℃，12000rpm 离心 15min；取...
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