外源基因转化烟草悬浮细胞的研究
摘要
烟草悬浮细胞作为一种在生命科学领域研究比较广泛的实验材料。烟草悬悬浮细胞具有选材便捷、传代速度较快的优良特性，便于实验室操作和培养。通过把外源基因进行克隆和载体构建后转移到烟草悬浮细胞中，利用抗生素进行筛选，培养在固体培养基中，等到得到合适的愈伤组织后，再把愈伤组织转移到液体培养基中培养，利用农杆菌的介导作用筛选出含有外源基因的细胞，把含有外源目的基因的愈伤组织夹碎后放在含有培养液的锥形瓶中培养，把锥形瓶放到摇床上就能得到悬浮细胞。本文主要综述在实验室条件下通过农杆菌的介导、筛选出外源基因在烟草悬浮细胞中的转化及其烟草悬浮细胞的制备。
关键字：农杆菌的介导；外源基因的转化；烟草悬浮细胞的制备
Study on the transformation of tobacco suspension cells by exogenous genes
Student: qian hong instructor: feng hanqing
(college of life science, northwest normal university, lanzhou 730000, China)
Abstract：
Tobacco suspension cells are widely used as experimental materials in the field of life science.Tobacco suspension cells have the advantages of convenient material selection and fast passage speed, which is convenient for laboratory operation and culture.Through the exogenous gene cloning and transferred to the tobacco suspension cells after carrier construction, use of antibiotics screening, culture in solid medium, wait to get suitable callus, the callus again transferred to liquid medium culture, make use of agrobacterium mediated screen contains cells of the exogenous gene, the contain of the outside source purpose gene callus after minced in the conical flask containing nutrient solution culture, the conical flask on the table will be suspended cells.This paper mainly reviews the transformation of exogenous genes in tobacco suspension cells and the preparation of tobacco suspension cells by agrobacterium-mediated screening under laboratory conditions . Key words: Agrobacterium-mediated;Transformation of exogenous genes;Preparation of tobacco suspension cells
1、引言 烟草隶属于茄科烟草属植物，最早产自于南美洲，在中国南栽培栽培范围较广 [1] 。烟草是最先被应用到基因工程与分子生物学的研究的模式生物之一，享有“植物界的果蝇”的美誉；因为烟草的组织可操作性和再生能力较强，烟草的植株可以用作农药杀虫剂，也可以药用，可作为麻醉剂发汗剂、镇静剂和催吐剂。现代科学研究已证明，烟草具有十分重要的药用价值 [2] 。烟草悬浮细胞（BY2）于 1972 年由 Kato 等人分离而得到。此外烟草 BY2 细胞分化速度比较快，其细胞系具有较高的一致性，可在短时间内获得具大量的高度同一周期性的 BY2 细胞，因此 BY2 细胞已经成为生物研究的模式系统 [3] 。
在外源基因转化烟草悬浮细胞实验中，一般来说选择的外源基因的载体为农杆菌，可以把农杆菌 T-DNA 序列作为桥梁，遗传物质就能通过 T-DNA 序列进入到植物细胞中。可以把质粒进行改造用来表达目的基因，将选择的目的基因稳定地插入植物基因组中。在 T-DNA 中最重要的结构非它边界的两个小的重复序列莫属，在植物转化过程中必须有一个小重复序列的介导。
2、农杆菌
农杆菌属于土壤微生物的一种，裸子植物和双子叶植物能在自然条件下被侵染，但是对于大多数单子叶植物来说是不具有侵染功能的 [4] 。农杆菌的类型主要有两种，即能够在植物受伤部位产生瘿瘤的根癌农杆菌和促进植物产生毛根的发根农杆菌 [5] 。
T-DNA 序列存在于农杆菌质粒上，农杆菌可以通过侵染植物受伤部位进入到细胞中，由此把 T-DNA 植入到植物基因组中 [6] 。所以，农杆菌介导的转化是自然界中最普遍的转化方式，因此，享有“自然界中最小的遗传工程师”的美誉 [7] 。转基因植物的获取，是以农杆菌的侵染为中间条件，通过把 T-DNA 区域进行重新构建，最后把目标基因转入重新构建好的 T-DNA 区中，通过采用细胞培养和植物组织培养技术得到转基因植物。
[8] 。
在植物界中，最开始被应用到农杆菌介导的植物是双子叶植物，但是随着实验技术和方法的进步与发展，农杆菌介导法在某些单子叶植物中也得到了较为普遍的运用 [9] 。此外，生物学家还把转化了的发根农杆菌，培养在液体培养基里面，不久就会长出许多密度比较高的根，因此，如果需要许多蛋白质，可以采用此种方法 [10] 。
2.1 根癌农杆菌
在天然条件下它可通过植物受伤部位进入，致使植物位产生瘿瘤，先把自身的 T-DNA 序列转移植物细胞中，最后再整合到植物染色体上。其菌体形状为棒状，长度大约为两三个微米，运动是依靠于侧边鞭毛摆动。但是生长在侧边的鞭毛只有放大到 1000 倍时，用肉眼才能把它看得很清楚 [11] 。
在很多双子叶植物紧挨地面的根与茎相交的地方，会出现一种像帽子一样的瘤状物，被人们称为冠瘿瘤病。根癌农杆菌曾在澳大利亚和法国的葡萄树上产生许多帽状的肿瘤，给当地人民的生活和经济造成了较大的影响 11。农杆菌大多存在与双子叶植物中，根瘤细胞所需的各类营养物质均来自于植物细胞，以此来保障根瘤细胞的正常生长。
可以依据功能的不一样原始 Ti 质粒可分为 4 个区域：T-DNA 区、毒性区(vir 区)、接合转移区(Con 区)、接合转移区(Con 区)。可以把酚类物质和糖类物质当做根瘤农杆菌的趋化物，可以诱导农杆菌中 Ti 质粒上 Vir 区基因，活化 Vir 的区基因，致使 T-DNA 自身进行转移与加工，植物细胞因此而被感染 [12] 。
基因敲除是根癌农杆菌介导植物细胞转化的最直接和有力的方法 [13] 。研究反向遗传学的方法有两种，一种是宿主基因组同源的序列与 T-DNA 中所含有的一样时，T-DNA 以同源重组的方式进入基因组，但是双交换同源重组占一定比重 [14] ；另一种研究方法则是插入突变[15] 。受体染色体同源序列在 T-DNA 中没有时，T-DNA 以异源重组的方式进入到染色体基因组中 [16] 。
2.2 发根农杆菌
土壤发根农杆菌是一种具有较强侵染性的土壤细菌，发根农杆菌侵染植物所产生的发根具有生长速度迅速、分化程度比较高、生理生化和能在子代中稳定遗传、操作所需的方法和仪器较为简单便于人为控制等优点 [17] 。
其原因是自身携带有 Ri 质粒，Ri 质粒上含有负责自主性生长和发根瘤合成冠瘿碱的基因。在构造上，Ri 质粒与 Ti 质粒类似，它主要分为 T-DNA 区、Vir 区及其内合成冠瘿碱功所需的能区等 [18] 。Ri 质粒能够引发植物大量细胞繁殖，并且能诱发产生发根瘤。Ri 质粒与根癌农杆菌 Ti 质粒所诱发的冠瘿瘤具有相同之处，也有不同之处。两者的相似之处在于：
（1）毛根的形成与发根农杆菌所密不可分，要想形成毛根，就必须要发根农杆菌去感染植物的组织细胞。此外，在某些宿主植物上会长出像瘤一样的冠瘿，虽然与发根瘤长得很像，但这是由于发根农杆菌的诱导作用形成的。
（2）发根农杆菌侵染植物时发根瘤组织会产生一种叫做农杆碱的物质，会诱导植物产生产生毛根毛根或者毛是没有结构的瘤状组织，在离体条件下培养的毛根，能长成一棵完整的植株，这就是发根农杆菌在植物转化方面比根癌农秆菌用途较广的原因 [19] 。
要想检测出非蛋白态的氨基酸，只有在携带有完整 T-DNA 的 Ri 质粒的转化植物细胞中一般能检测到，这即冠瘿碱。T-DNA 上有冠瘿碱所合成的基因，转录只存在于真核细胞中，而在不能农杆菌中进行转录。碳源和氮源来自于寄主细胞所合成的冠瘿碱，而对寄主植物本身则没有用处。发根培养技术虽说起源于现在，在植物基因工程迅猛发展的今天，以农杆菌技术介导植物转化已然非常普遍，其中得力于农杆菌中的作为载体的 Ri 质粒。我相信随着科学技术的发展和对 Ri 质粒的深入研究，Ri 质粒由于自身能够诱导植物生根，Ri 质粒将会比 Ti 质粒运用到生产生活的范围更广，Ti 质粒则可以依据它可以诱导植物产生瘤状物，可以从中分离出一些对人类有用的物质。
2.3 农杆菌介导的转化的特点有：
1、农杆菌的 Ti 质粒转化系统是利用自然转化的载体系统，转化成功率较高，而且效果相比于其他基因转化体系的好很多 [20] 。
2、农杆菌的 Ti 质粒转化系统的机理相对于其他方法较为研究的清楚和成熟，且运用的范围也比较的广泛。
3、遵循孟德尔遗传规律，其外源基因大多为单拷贝数，遗传特征的稳定性较好，可为遗传育种提供中间选育材料。
4、系统操作和所用仪器设备较为简单，易于农业推广与研究。
3、转化过程
农杆菌转化法的原理是构建双元表达载体系统。大肠杆菌中的穿梭质粒和农杆菌中的辅助质粒共同组成了双元表达载体系统 20。经过电转化后的重组质粒进入到农杆菌感受态细胞里面，再用内含重组质粒的农杆菌去侵染植物根部切口部位，最后再通过反式作用于辅助性质粒毒性区的表达蛋白与重组质粒目的片段以此激活 T-DNA 转移，以此把含有目的片段的基因整合进入植物细胞基因组中。通过形成愈伤组织，这样刚分裂形成的细胞中就会含有该目的基因[21] 。
转化过程中最重要和最关键的程序，就是把 DNA 插入到宿主细胞基因组中 [22] 。T-DNA整合在寄主细胞染色体上是随机的，但对转录活化区域却是有选择的。T-DNA 通过与 DSB 发生重组来完成整合，从而进行表达。
当植物体受到自然因素影响时，产生的伤口处细胞就会有大量酚类化合物的产生，受伤部位的细胞以此来引诱去农杆菌接近它，受体细胞则会慢慢靠近 Ti 质粒上的 T-DNA，使受体细胞染色体的 DNA 上含有 Ti 质粒上的 T-DNA [23] 。依据农杆菌的这种特点，在 Ti 质粒的 T-DNA上移入所需的目的基因，再通过农杆菌的介导作用，植物细胞中就会含有目的基因，在通过以一些方法让植物细胞染色体 DNA 中含有所需的目的基因，这样其遗传特性得以稳定的在后代中传承 [24] 。将目的基因导入植物细胞所采用最普遍的方法就是通过农杆菌 Ti 质粒介导作用[25] 。
Ti 质粒和 Ri 质粒存在于根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中 [26] ，其上含有一截 T-DNA，农杆菌通过侵染植物受伤部位进入细胞后，把 T-DNA 植入到植物基因组中 [27] ，稳定的把优良性状遗传给后代，因此这一特征为农杆菌介导植物转基因转化奠定了坚实理论与操作基础9 。
利用农杆菌与植物离体组织共培养进行转化植物，一般需要经过严格筛选错误 错误!未定义书 未定义书签。
签。。质粒 T-DNA 是随机进入到宿主细胞的基因组中的 [28] 。通过修改质粒以表达目的基因，可以将选择的目的基因稳定地插入植物基因组中。T-DNA 唯一重要的部分是它的两个小的边界重复序列，其中至少有一个是植物转化所必需的。
农杆菌介导的植物转化的方法有以下两种：
3.1 叶盘法
无菌苗要挑选强壮且无虫害，用打孔器在叶片上打出小叶圆盘，在培养基中导入含有外源基因的农杆菌培养液，再把刚打出来的叶圆盘放入培养液中，让两者在培养基中短时间培养。农杆菌可以把叶片的受伤部位作为桥梁，将携带外源目的基因的 Ti 或 Ri 质粒带进入植物细胞，使植物基因组含有所需的外源目的基因，它是双子叶植物最常用也最简洁且成功率较高的方法 [29] 。
3.2 真空渗入法
在培养基中放入含有外源基因的农杆菌培养液，把挑选出来强壮且无健康的烟草幼苗倒放在培养基中浸泡；在经过真空处理，制造伤口，让幼苗的受伤部位产生的酚类物质就会吸引农杆菌进入细胞，在农杆菌介导作用下，使幼苗发生遗传转化，此方法是一种操作简单、能快速得到结果其结果准确，而且不用把幼苗进行组织培养，能节省一大部分时间29 。
4、烟草悬浮细胞的制备
烟草隶属于茄科烟草属的一年生草本植物，且烟草组织的可操作性和再生能力都比较强，
在实验室条件下易于培养，已经成为了实验室植物培养的宠儿，是深入研究茄科植物的模范植物，在植物的遗传育种等方面研究较为突出。
烟草悬浮细胞具有以下特征：对剪切力反应较为敏锐；结团；多泡沫；具有流体学特征。植物悬浮细胞的培养是在实验条件下，由人工完全控制而培养出来的，因此可以不受外界自然条件和人为因素的干扰，生活周期较短，可以人为的进行筛选。悬浮细胞系的构建主要依靠于基因工程技术，其主要原理是植物细胞的全能性。是否能成功的构建一个悬浮细胞系受到诸多的影响因素，建立一个稳定的细胞悬浮系,是由愈伤组织的状态是否合适所决定的。
4.1 悬程细胞的的培养过程
4.1.1 愈伤组织的诱导
愈伤组织是植物在受到外界创伤刺激后，在受伤部位产生的新的植物组织，植物的任何组可以运用到植物的无性生殖中，即植物的嫁接和扦插，使母本的优良性状直接传递到子代中，不受某些外部因素的影响。在构建悬浮细胞系中愈伤组织起到了一定的作用，在继承培养的时候已经充分的发育，如果不及时将它从外植体上分离下来，则自身的特性就会受到一定程度的影响。在外植体的创口上一般都会产生愈伤组织,由于外植体选择的不同，则所生产的愈伤组织的表现颜色和呈现状态都不一样 [30] 。
植物的愈伤组织在培养基上培养一段时间后会产生三种类型的愈伤组织，第 1 类是在植物的中下部叶片和茎段靠近培养基的地方产生的，其形态多为圆形，排列方式比较整齐和紧凑，表面具有白色的绒毛，整...
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