姓名： 李果 学号：201030380109 院系：动物科学学院10级动物生物技术
《生物技术制药概论》综合性实验
“动植物超氧化物歧化酶SOD的制备”
背景介绍：超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）可能与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫疾病和辐射防护有关，是一种重要的蛋白质类药物，可用于炎症、类风湿关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等。SOD存在于动、植物、微生物中，有Cu-Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD等多种形式存在。植物SOD的研究今年来引起了科学家的特别重视，因为SOD具有清除体内过量的超氧自由基（O2-）的功能，对于预防衰老、血管硬化等有显著效果，对疾病的治疗也初步显出疗效；植物来源的SOD稳定性较动物来源的好，特别是类-SOD，因相对分子量较小，易透性好，引起保健品、美容品方面的特别重视。比较好用的品种有刺梨、茶叶等植物的SOD。此外，植物SOD酶在农业新品种培育研究中也有重要意义。
该综合性实验涉及本科程动物细胞制药、植物细胞制药及酶工程制药。实验过程综合了药物制备的重要步骤，如：收集、植物干粉制备、丙酮抽提、清洗、溶血、去血红蛋白、沉淀、热处理、分离、透析浓缩、蛋白质类药物的纯化技术、酶类药物的活性测定等。
实验目的
通过本实验学习，使学生掌握生物技术制药的重要章节：动物细胞制药、植物细胞制药、酶工程制药，提高学生运用知识、对理论知识的应用等综合能力。
实验原理
将动植物材料用不同的方法进行细胞破裂后用缓冲液浮洗，再用乙醇、氯仿去除杂质沉淀，在硫酸铵、丙酮作用下使SOD沉淀；最后进行溶解，并用透析、柱层析（DEAE-Sephadex A50;Sephadex G-100;DEAE-cellulose）的方法进一步纯化，得到SOD纯品。
实验步骤
3.1 实验材料：
新鲜桑叶、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠
3.2 实验步骤：
[制干粉][提取] 新鲜桑叶丙酮桑叶丙酮干粉磷酸钾缓冲液
[制干粉]
[提取]
新鲜桑叶
丙酮
桑叶丙酮干粉
磷酸钾缓冲液
上清液
丙酮
[沉淀酶]
沉 淀
pH7.8 磷酸钾缓冲液
[透析，浓缩]
超滤浓缩
浓缩酶液
Sephadex G-100
[柱层析]
活性组分
DEAE-Cellulose
[离子交换]
梯度洗脱
SOD纯品
桑叶SOD制备的技术路线
（1）桑叶→大量清水洗涤干净→蒸馏水洗涤→滤纸吸干称50g→研磨机研磨→过滤→上清液→测定体积（V1）
（2）上清液→60℃水浴20min（去杂蛋白）→10000r/min冷冻离心20min →上清液→测定体积（V2
B、纯化（硫酸铵分级沉淀法）
按A的体积查出0℃
50%饱和度 4℃
↓ 10000r/min 20min
上清液
↓
90%饱和度 4℃
↓乙醇氯仿去离子水冷水洗涤 10000r/min 20min
乙醇氯仿
去离子水
冷水洗涤
沉淀 5mmol/L PH7.8PBS
C、按表中试剂用量加入试管并在25?C保温25min。
solution
blank
control
sample
PH8.3PBS
4.7ml
4.7ml
4.5ml
HCl
10μl
SOD sample
0.2ml
邻苯三酚50mmol/L
10μL
10μL
V总
4.7ml
4.7ml
4.7ml
注：缓冲溶剂的配置根据附表的相关浓度进行
D、活力测定：
将样品溶液倾入1 cm 的比色杯中,在325 nm 处每隔30 s 测定吸光度1 次,选择时间范围,控制对照管每分钟吸光度的变化速率在0.070 左右,记录样品溶液每分钟` 。
E、酶活力的计算:
SOD 活力(U·mg - 1 ) = (0.070 - △A325 ) ×100 % ×V总÷0.070 ×50 %·V定义·V样。
其中: V总代表反应总体积,
V样代表加入样品液的体积,
V定义代表活力单位定义体积(1 ml) 。
实验数据和实验结果
1、称取桑叶重量：50.1246g
2、粗提过程：
（1）实际加入缓冲液体积：70ml V1：40.80ml V2：未测出
（2）分别稀释倍数： 0.711倍 未测出
（3）测定前再稀释倍数：未知
3、酶活力测定获得两组数据：
x1 x2 x3 x4 （未测出） 即可根据测出值计算△A325
x1 x2 x3 x4 （未测出） 即可根据测出值计算△A325
将以上数据带入公式：SOD 活力(U·mg - 1 ) = (0.070 - △A325 ) ×100 % ×V总÷0.070 ×50 %·V定义·V样，即可得到桑叶中SOD的酶活力。
实验结论及心得
实验结论
本次实验由于实验仪器的故障问题（离心机破损）导致实验最终无法顺利完成，只能完成实验的前半部分，因此无法测定出桑叶中超氧化物歧化酶SOD的活力；
基本获得的数据：
包括：桑叶称重：50.1246g；V1：40.80ml
实验虽然没有得出最终的结果，但是通过此次实验的进行，我们了解到了超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）可能与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫疾病和辐射防护有关，是一种重要的蛋白质类药物，可用于炎症、类风湿关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等的重要作用，以后有机会会对其进行更加深入的了解与探讨；
（二）实验心得
1、此次实验的进行，运用到了许多相关学科的知识，如需要了解桑叶与猪血的生理性质、化学缓冲试剂的配置等基础学科知识。实验进行过程中，对实验流程不够熟悉，充分说明我们对自主创新性实验基本技能的欠缺以及缺乏自主创新意识，在以后的学习过程中，还得注重对基本实验技能的培养以及自我实验素质、创新性意识的提高。
2、另一方面，还得加强自主学习能力，提高自主学习意识，通过自学去提前掌握实验原理、将实验操作步骤熟记于心，这样实验才能顺利进行，才能较高质量的完成创新实验。
3、提前做好实验准备是实验良好进行的基础，但实验过程中做好记录以及实验后的认真反思以及对实验前存在问题的探究是实验后期获得实验成果的重要保证。
4、总之，通过此次实验，我对创新性试验有了一个较为全面的认识，对以后的学习以及自主实验的进行有了一个深入的了解，在以后的自主实验的进行中，我想我能够准备得更充分，有信心让实验顺利及有效的进行。
5、实验后及时与指导老师沟通，探讨实验中存在的问题，更好的解决实验残留问题，以期获得良好的收益。
（三）实验过程中的难点
（1）活力测定：
将样品溶液倾入 1 cm 的比色杯中，在 325 nm 处每隔 30 s 测定吸光度 1 次，选择时间范围，控制对照管每分钟吸光度的变化速率在0.070 左右，记录样品溶液每分钟吸光值读数 。
（2）酶活力的计算:
SOD 活力(U·mg - 1 ) = (0.070 - A325 ) ×100 % ×V △ 总÷0.070 ×50 %·V 定义·V 样。其中: V 总代表反应总体积，V 样代表加入样品液的体积，V 定义代表活力单位定义体积(1 ml) 。
附表：硫酸铵共沉淀法浓度差查阅表
附表： 硫酸铵共沉淀法浓度差查阅表
附表0.1M磷酸钾缓冲液
姓 名：李果
班 级：10级动物生物技术1班
学 号：201030380109
指导老师：李文楚 老师
2013年6月
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